常見肉類鑒別技術研究進展

摘  要：肉類作為我們日常食物的重要組成部分，其真實性是食品安全的關鍵問題。近年來，食品安全問題，尤其是市場上各種肉類摻雜、摻假事件，成為人們日益關注的焦點。嚴格監測市場上肉制品，必須要有可靠、簡便、快速的技術作支撐。本文綜述了現階段常見肉類鑒別技術的研究進展，并著重描述了聚合酶鏈式反應(polymerasechain reaction, PCR)技術，因其靈敏度高和特異性高、簡便且耗時少，逐漸成為肉類檢測的實用技術。

關鍵詞：肉類檢測；傳統方法；免疫學技術；聚合酶鏈式反應（PCR）技術

ATechnological Overview for Identification of Common Meat Species

Abstract: Asmeat is an important part of our daily food, the authenticity of meat is amajor issue of food safty. Recently, more of us have been focused on the issuesof food safety, especially the occurrence of meat products adulteration. Todetect and prevent meat species substitution, a kind of reliable, convenientand rapid technologies must be developed. This paper provides an overview ofthe developed approaches and highlights the DNA-based polymerase chain reaction(PCR) technology. Due to the high sensitivity, specificity and convenient ofPCR assay, as well as its low time-consuming, PCR-based techniques will be thepractical technologies to detect meat and meat products.

Key words: meat species identification；traditional methods；immunological technique；polymerase chain reaction (PCR) technique

近年來，食品安全問題頻發，食品的衛生與安全逐漸成為人們關注的焦點。我們直擊國內的 “老鼠肉、狐貍肉、水貂肉冒充羊肉”事件、“清真招牌下的豬肉冒充羊肉”、“羊肉卷添加豬肉鴨肉”事件和席卷多國的“馬肉風波”以及普遍存在的香腸摻雜摻假等現象……這些與價格、原料和宗教有關的種種事件，威脅到人們的日常生活和宗教信仰。由此看來，食品安全問題不可小覷，特別是對肉類的鑒別，這需要我們能夠有可靠且可行的方法進行檢測。現階段肉類檢測方法眾多，包括傳統方法與現代方法，經典方法與新興方法。本文綜述了肉類鑒別的主要方法，包括傳統感官鑒別、免疫學方法、分子生物學方法以及其它方法。

1  傳統方法 

鑒別肉類的傳統方法主要包括視覺、嗅覺、觸覺、味覺等。視覺鑒別指通過對動物肉的酮體、肌肉紋理和顏色、脂肪等直接觀察判斷；嗅覺鑒別指對肉品的氣味判斷鑒別；觸覺鑒別指按壓生肉品，感知肉品的脂肪、肌肉的硬度和彈性來判別；味覺鑒別是通過對肉品經加工后的味道來判別。僅僅的感官判別遠不能夠鑒別肉類的真假，可作為輔助手段應用。

2  免疫學方法

免疫學方法主要包括試管沉淀法、瓊脂擴散法、對流免疫電泳法、放射免疫法、免疫組化法和酶聯免疫吸附分析(enzyme-linkedimmunosorbnent assay，ELISA)，其中試管沉淀法應用較少，ELISA較為常用。馬永征等詳細綜述了以ELISA為主的免疫學技術在肉類制品檢測中的研究進展。ELISA用于肉類鑒別的原理是利用抗體對蛋白的識別來區別肉類品種，包括直接法、間接法、間接競爭法、ABS-ELISA法、組織印記法、捕獲包被法、A蛋白酶聯法、斑點免疫吸附法和雙抗體夾心法。有人綜述了ELISA技術在肉類檢測中的應用，分析了該技術廣泛的應用前景。利用雙抗夾心ELISA技術鑒別不同肉類，結果表明該技術有較高的敏感性和特異性，并制成商品化診斷盒，以便于有關部門應用。ELISA技術與傳統鑒別技術相比，較靈敏可靠，但存在一些弊端，如目標分子含量低，各種肉類特異性抗體難以制備且存在交叉反應等。

3  分子生物學技術

聚合酶鏈式反應(polymerase chainreaction，PCR)技術是經典的分子生物學技術，通過設計特異性引物，擴增出特定目的DNA片段，經瓊脂糖凝膠電泳分離不同大小的DNA片段，以用于鑒別和檢測。PCR技術用于肉類鑒別，關鍵在于能夠找到各類物種特異性的基因片段，并設計引物擴增目的片段。現常用線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA），原因在于線粒體DNA比核基因小，為環狀結構，穩定且數量較多，易于進行PCR擴增；2）線粒體DNA比核基因小，自我復制較快，在一定程度上比核基因進化速度快，導致其存在廣泛的種內和種間多態性，適用于相近物種的鑒別；3）線粒體DNA中某些基因區域具有高度保守性，可通過設計通用引物，擴大所鑒別的物種范圍。經分析總結，現階段常用于擴增的線粒體DNA區域包括細胞色素b（cytochrome b,cyt b）、16SrRNA、12SrRNA、D-loop、ATP6和ATP8等，較少應用Myostatin基因 。而本實驗室目前以線粒體基因組為模板設計引物，并不局限于某個特定區域，設計方法比較獨特。現階段國內外運用PCR技術以線粒體基因組作為目的基因鑒別肉類的常見應用如表1、表2所示。常用的PCR技術有常規PCR、多重PCR(multiplexPCR)、實時熒光定量PCR(real-timefluorescence quantitative PCR，RT-PCR)、限制性片段長度多態性PCR(restrictionfragment length polymorphism，PCR-RFLP)、隨機擴增多態性PCR（Random AmplifiedPolymorphic DNA PCR，RAPD-PCR）等。

表1  以PCR技術為基礎常見肉類鑒別的國外研究現狀

Table 1 A foreign overview of species identification of common meat by PCR

3.1  常規PCR

常規PCR技術指在PCR反應基本組成成分基礎上發生聚合酶鏈反應的技術，同一體系內只有一對引物和單一目的模板，操作簡單、快速。侯東軍等以豬的細胞色素b基因為模板，設計引物，建立了一種檢測牛羊肉中豬肉成分的方法，省時且特異性高。客觀看來，常規PCR方法較傳統方法靈敏，特異性高，較免疫學方法省時，但缺乏對比，需要多組之間相互比較。

3.2  多重PCR(multiplex PCR)

多重PCR指在傳統的常規PCR基礎上，于同一體系中加入多對特異性引物，對多個DNA模板或同一模板的不同區域擴增出多個目的片段。宗卉 等在PCR體系中同時加入通用引物和牛、羊的特異性引物及牛、羊的mtDNA，建立了多重PCR同時檢測牛、羊源性成分的技術，特異性高，省時省力。更巧妙的是，等使用多重PCR鑒定了牛、豬、雞、綿羊、山羊和馬 6種肉類，即在線粒體細胞色素b基因上設計了一條通用的上游引物和各自特異的下游引物，于同一體系中擴增出各自特異的目的片段，并同時得到各種DNA樣品的檢測極限。

值得注意的是，多重PCR技術可同時加入多對引物，同時擴增幾個DNA片段，前提是每對引物都能在單一PCR體系中應用且結果理想，當同時將幾對引物加入一個體系中，需要重新摸索條件。多重PCR反應體系的設計需要考慮到各對引物及模板的濃度、每對引物的溶解溫度和引物之間的相互作用以及目的片段的長度等。建立理想的多重PCR體系可以達到省時、經濟、節約的效果。

3.3  實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitativePCR，RT-PCR)

實時熒光定量PCR技術是在常規PCR反應體系中加入熒光基團，根據熒光信號的強度，利用標準曲線、Ct值等對未知模板進行定量分析的方法。RT-PCR技術中TaqMan RT-PCR技術和SYBR Green RT-PCR技術應用最為廣泛。前者的原理是根據在PCR擴增時，熒光標記探針被降解，發出熒光信號，實現了熒光信號的累積與PCR產物的形成的完全同步，通過監測系統來定量；后者的原理是于SYBR熒光染料特異性地插入到DNA雙鏈之后發射熒光信號，使得熒光信號與PCR產物同步增加，同樣通過熒光監測系統來定量。本實驗室現以馬肉線粒體DNA為模板，設計出馬的特異性引物，利用RT-PCR技術鑒別馬肉及定量肉制品中馬肉含量。

TaqManRT-PCR技術可用于單一成分的檢測，李林 等應用多重實時熒光定量PCR技術，根據牛、山羊和綿羊線粒體細胞色素b基因的差異，設計出特異性的引物和Taqman探針，建立了能夠同時鑒別三者的PCR技術，并與國標方法比對分析，該實驗方法無需電泳、酶切和測序，使得檢測效率提高近3倍，靈敏度比國標方法高10倍，適用于檢測肉類、奶品、生皮、飼料和動物油脂等動物產品的牛羊源性成分；該方法還可以用來確定檢測限及定量限，JohnJ. Dooley 等同樣在細胞色素b基因上設計出特異性引物和熒光探針，建立了適用TaqMan RT-PCR技術檢測牛肉、豬肉、羊肉、雞肉和火雞肉的方法，且檢測限低于0.1%。Soichi Tanabe  ADDIN EN.CITE等在細胞色素b基因上設計出特異性引物和熒光探針，建立了鑒別食物中微量的豬肉、雞肉、牛肉、羊肉和馬肉的實時熒光定量PCR方法。該方法使定量極限達到100fg/ul，對加工食品中微量肉源檢測有很大的幫助。

SYBRGreen I RT-PCR技術同樣可用于定量，楊麗霞 等設計了一對特異性引物，使用SYBR Green I 實時PCR技術，建立了RT-PCR檢測牛肉中鴨源性成分的檢測方法，檢測靈敏度可達到1pg。該方法比較靈敏，但其存在SYBR Green I熒光染料對DNA雙鏈模板無選擇性等特點，特異性較TaqManRT-PCR差，但成本較TaqManRT-PCR成本低。

總體來說，熒光定量PCR技術可以在定性的基礎上，達到定量檢測的要求。與其他PCR方法相比，在PCR技術的高特異性、高靈敏度的基礎上，同時做出定量檢測，簡便可靠，可作為鑒別肉類的實用技術。

3.4  限制性片段長度多態性PCR(restriction fragment lengthpolymorphism，PCR-RFLP)

限制性片段長度多態性PCR技術，即PCR-RFLP，是PCR技術和RFLP技術聯合應用。該方法通過設計適當的引物，擴增一段含有特定限制性內切酶酶切位點的DNA片段，經酶切和瓊脂糖凝膠電泳，得到特異性的條帶，以鑒別不同基因型。VioletaFajardo等 詳細綜述了以PCR技術為基礎的肉源性鑒別，給我們提供了大量PCR-RFLP技術在肉類鑒別中的研究與應用。

PCR-RFLP技術現已應用于肉類真實性的檢測，如馮海永等在線粒體DNA細胞色素b基因上設計出羊（綿羊、山羊）和鴨的通用引物，擴增出472bp的片段，分別使用限制性內切酶SpeI和Bsu36I對羊和鴨的PCR產物進行酶切，分別得到羊（綿羊、山羊）和鴨的特異性片段為213bp和259bp、95bp和377bp，可作為一種對羊肉和鴨肉快速鑒別的簡便可行的方法。該方法也已用于多樣品的檢測，如高林 提取出豬、牛、羊、雞、鴨、兔、魚的生肉DNA和市售的肉源性食品中肉類的DNA，使用線粒體通用引物（Cytb1/Cytb2）進行擴增，并對特異性陽性結果進行了限制性內切酶Mbo I、Alu I、Sau3A I酶切鑒定，結果表明此種PCR-RFLP方法可準確鑒別制品中相關肉源性成分。

PCR-RFLP方法較經濟，操作簡單易行，尤其適合多樣品的定性研究，較單純的RFLP方法省時、省力。

3.5  隨機擴增多態性PCR（Random Amplified Polymorphic DNA PCR，RAPD-PCR）

隨機擴增多態性PCR，即RAPD-PCR，是RAPD技術與PCR技術的聯合應用。該技術以PCR技術為基礎，設計一系列（通常數百個）互不相同的隨機排列堿基順序的寡核苷酸單鏈（通常為10聚體）為引物，對目的基因片段進行PCR擴增，聚丙烯酰胺或瓊脂糖電泳分離，經EB染色或放射自顯影來檢測PCR產物，以觀察DNA片段的多態性。

PCR-RFLP方法在肉類鑒別中的經典應用是在1998年Iciar Martinez ADDIN EN.CITE等利用RAPD-PCR技術成功的鑒別了牛、馬（6個品種）、騾、驢、水牛、麋鹿、馴鹿、豬肉、羊羔、山羊、袋鼠、鴕鳥以及其他肉類，并且實驗得到清晰的DNA指紋圖譜，很容易的辨別出以上樣品。該實驗表明RAPD-PCR技術不失為是一項簡單、可靠和快速的以DNA為基礎的分子生物學技術。也分別利用物種特異性的DNA指紋圖譜，用此方法鑒定肉制品真實性。

RAPD-PCR技術可以分析已知和未知物種的DNA多態性，且對DNA的純度要求不高，但是也存在一些不足，因其所用的引物比一般PCR反應短，有時會產生多態性DNA電泳圖譜，會使實驗結果分析帶來困難以及實驗重復性差；圖譜中的弱帶重復性差，在未標準化引物數目、引物長度和反應條件時，結果不具有可比性；假陽性和假陰性結果出現率相對較高。

4  其它分析方法

其他肉類鑒別有關方法包括：a）超聲波技術，即根據一些參數的變化檢測肉類的物理性質，如肌肉和脂肪厚度，可用于檢測肉類組成成分 ADDIN EN.CITE 近紅外光譜（nearinfrared，NIR）技術分析，可用于鑒別肉品種類、產地和真偽，此方法簡便快速且信息量大、無破壞性，但也存在成本高、頻繁維護和改進模型等不理想的方面。這兩種技術均無需對肉品進行破壞，且樣品能夠反復利用，可稱為無損檢測技術。